細胞傳代是細胞培養(yǎng)中最基本也是最常見的操作，傳代的意義是在于可以幫助我們擴大細胞培養(yǎng)的總數，同時避免細胞在長滿培養(yǎng)瓶/皿后開始老化衰敗進而死亡的情況。接下來會以“貼壁細胞”為例來進行傳代操作詳解。

操作準備

相較于細胞復蘇凍存，我們細胞傳代所需要做的準備工作是最多的，好記性不如爛筆頭，我們需要在每一次實驗前列好所需的實驗器材、實驗試劑。需要提前將無菌服、移液槍頭、廢液缸等實驗器材進行高溫高壓滅菌，并將所需的各類細胞的血清、培養(yǎng)基、胰酶溶液、雙抗以及支原體清除劑等確定用量后提前規(guī)整放置，保證可以一次性放入傳遞窗中，避免反復進出細胞房造成污染。

用量確定方法：以單瓶細胞1:3傳代為例，每個T25培養(yǎng)瓶所需完全培養(yǎng)基6ml，終止消化反應所需完全培養(yǎng)基6ml，所以總共需要配置24ml完全培養(yǎng)基。

當我們做好以上準備后，我們接下來就可以正式開始我們的傳代步驟了。

Operating Steps

操作步驟:

消洗后進入準備間，穿戴好滅菌服、滅菌手套以及口罩等防護用具進入細胞房。

取出需要傳代的細胞后進行觀察，彼此匯合率超過80%或細胞密度達到約8×10^5cells/ml左右時可以進行傳代。

根據不同的細胞特性選取不同的血清、培養(yǎng)基進行完全培養(yǎng)基配置完全培養(yǎng)基，普遍推薦比例為 1%P/S + 10%FBS + 基本培養(yǎng)基 （如擔心支原體污染可酌情加入1%支原體清除試劑）。

配置完成后從細胞培養(yǎng)箱中取出需要傳代的細胞瓶，消毒操作后用移液槍移去舊的培養(yǎng)液，加入1-2ml PBS緩沖液洗滌2次（加入PBS時需要從無細胞的一面加入，避免沖掉細胞）移除PBS緩沖液。

用移液槍加入2ml胰酶溶液（需在37%水浴鍋中預熱）輕微晃動使胰酶與細胞完全接觸后靜置在細胞培養(yǎng)箱中消化15-30s（具體胰酶含量以及消化時間需要視具體細胞情況而定）。

當肉眼觀察細胞培養(yǎng)瓶中細胞層呈現磨砂狀且有細胞下流或在倒置顯微鏡下觀察細胞變圓潤且大量脫落時，準備終止消化。

用移液槍加入等量完全培養(yǎng)基沖洗細胞終止消化，充分吹打細胞保證完全終止并且避免產生氣泡。

將細胞懸液轉移至離心管內，設置1000r/min速率離心3min。

離心完成后將上清液倒去，加入新的完全培養(yǎng)基吹打混勻細胞（避免產生氣泡影響細胞活率）取樣觀察計算細胞數以及細胞活率，根據數據決定傳代比例。

同樣以1:3傳代為例，加入18ml完全培養(yǎng)基完全混勻后，在每個無菌T25培養(yǎng)瓶中移取6ml細胞懸液分裝，顯微鏡下觀察狀態(tài)后有序放置在37 、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

至此傳代完成

細胞傳代小貼士TIPS ：

1、全程需嚴格無菌操作；

2、細胞較脆弱，吹打細胞過程需輕柔；

3、每次移液后需要更換槍頭，避免造成溶液交叉污染；

4、胰酶消化時間太久會加速細胞老化，需嚴格控制消化時間。