放線菌是重要的天然產(chǎn)物生產(chǎn)菌種，具有頗高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。多數(shù)工業(yè)放線菌難以進(jìn)行基因操作，工業(yè)放線菌的馴化多依賴傳統(tǒng)的隨機(jī)誘變方法。而此類方法往往產(chǎn)生的隨機(jī)庫突變體數(shù)目龐大，正突變率低，傳統(tǒng)的基于孔板培養(yǎng)和產(chǎn)量測定的低通量篩選方法難以與其適配，因此開發(fā)次級代謝產(chǎn)物導(dǎo)向的放線菌高通量篩選方法對于天然產(chǎn)物生產(chǎn)具有重要意義。

中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員王猛帶領(lǐng)的高通量編輯與篩選平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室，與天津科技大學(xué)教授花爾并團(tuán)隊(duì)合作，開發(fā)了基于全細(xì)胞感應(yīng)菌與生產(chǎn)菌共培養(yǎng)的液滴微流控篩選方法WELCOME（whole-cell biosensor and producer co-cultivation based microfluidic platform for screening actinomycetes），首次實(shí)現(xiàn)了次級代謝產(chǎn)物導(dǎo)向的放線菌高通量篩選。研究以重要的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素為例，通過體外實(shí)驗(yàn)表征了大腸桿菌MphR生物傳感器對于紅霉素的感應(yīng)情況，后在液滴中建立大腸桿菌與放線菌共培養(yǎng)體系，將生產(chǎn)菌紅霉素的產(chǎn)量信息轉(zhuǎn)化為可視化的感應(yīng)菌大腸桿菌綠色熒光信號(hào)，通過優(yōu)化分選參數(shù)，使紅霉素高低產(chǎn)人工混庫的FADS篩選富集率達(dá)到310.9。研究從一株紅霉素高產(chǎn)工業(yè)菌株出發(fā)，利用WELCOME通過兩輪迭代突變和篩選，在大于10萬個(gè)突變株的隨機(jī)庫中篩選得到多個(gè)高產(chǎn)突變株，效價(jià)最高可提高50%。研究通過對多個(gè)高產(chǎn)突變株的基因組測序和生物信息學(xué)分析，篩選到3個(gè)對于產(chǎn)量提升有潛在作用的位點(diǎn)，解釋了突變株的高產(chǎn)機(jī)制，并用反義RNA抑制策略驗(yàn)證了其中一個(gè)關(guān)鍵基因突變對于紅霉素生物合成的影響，為進(jìn)行菌株的理性代謝工程改造提供了可能的靶點(diǎn)。

在篩選方面，WELCOME方法無需對次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)菌進(jìn)行基因操作，可規(guī)避工業(yè)放線菌的基因操作難題，且篩選過程快速高效，單輪篩選可壓縮至45天之內(nèi)，并可通過多輪迭代誘變和篩選獲得更優(yōu)異的突變株。該方法變革了原有的產(chǎn)物導(dǎo)向的放線菌篩選模式，對于其他工業(yè)放線菌的馴化和篩選具有借鑒意義。

相關(guān)研究成果作為封面文章發(fā)表在ACS Synthetic Biology上。研究工作得到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、合成生物學(xué)海河實(shí)驗(yàn)室重大攻關(guān)類項(xiàng)目及天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動(dòng)的支持。

封面文章

WELCOME高通量篩選工作流程

來源：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所