抗原設(shè)計(jì)FAQ

為什么要進(jìn)行抗原設(shè)計(jì)？

想要以高成功率獲取特異性好、有效性高的抗體，第一步抗原設(shè)計(jì)至關(guān)重要。

抗原設(shè)計(jì)過(guò)程中，你碰到過(guò)哪些頭疼的問(wèn)題，快來(lái)吐槽。

目前，用于免疫生產(chǎn)抗體的抗原一般有多肽抗原和重組抗原。兩種抗原各有優(yōu)劣，多肽抗原理論上來(lái)說(shuō)可以產(chǎn)生高特異性、針對(duì)特定抗原表位的抗體；缺點(diǎn)是免疫原性較低，需要和載體偶聯(lián)以增強(qiáng)免疫原性，這增加了抗原制備成本，另外還會(huì)產(chǎn)生大量針對(duì)載體的非特異性抗體，增加了后續(xù)純化和篩選成本。重組抗原免疫原性強(qiáng)，包含抗原表位多，用于制備抗體，相對(duì)成功率較高；但也有缺點(diǎn)，重組抗原一般采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)折疊方式與真核生物的有所差異，另外有時(shí)并不能獲取可溶性的抗原，進(jìn)一步導(dǎo)致所獲抗原與目的蛋白抗原的抗原表位并不完全一致，從而產(chǎn)生出一些非特異性的抗體，而這些非特異抗體在后期的純化過(guò)程中是很難被排除掉的。

設(shè)計(jì)抗原時(shí)，多肽抗原一般選擇10~20個(gè)左右的氨基酸，重組抗原一般為長(zhǎng)度在100個(gè)氨基酸以上的部分或者全長(zhǎng)蛋白。

設(shè)計(jì)抗原有哪些秘籍呢，準(zhǔn)備好接收了么？

設(shè)計(jì)抗原的基本原則

確定所需生產(chǎn)抗體的用途

明確所需生產(chǎn)抗體的用途對(duì)抗原設(shè)計(jì)有很大的影響。例如：如果需要利用得到的抗體來(lái)研究目的蛋白的特定區(qū)域，如C端或N端，那么抗原序列的選擇就應(yīng)集中在這一區(qū)域；如果想要用抗體來(lái)研究一種特定狀態(tài)下的蛋白，如磷酸化等，抗原設(shè)計(jì)的選擇性更小了，只有選擇該位點(diǎn)附近的合適氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)多肽抗原。

抗原序列區(qū)域的選擇原則

一般說(shuō)來(lái)最理想的抗原表位識(shí)別區(qū)域應(yīng)具備親水、位于蛋白表面和結(jié)構(gòu)上易變形性等特點(diǎn)。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)的天然（自然）環(huán)境中，親水區(qū)域傾向于集中在蛋白表面，而疏水區(qū)域常常被包裹在蛋白內(nèi)部。那么，我們?cè)谠O(shè)計(jì)抗原的時(shí)候，如果選擇這些具備親水、位于蛋白表面和結(jié)構(gòu)上易變形性等特點(diǎn)的區(qū)域的話，則有利于抗原產(chǎn)生與目的蛋白相同的抗原表位，從而生產(chǎn)出高親和力，高特異性的抗體。

連續(xù)的與不連續(xù)的識(shí)別區(qū)域

大多數(shù)抗體是針對(duì)連續(xù)識(shí)別區(qū)域的，抗體能與這類區(qū)域以很高的親和力相結(jié)合表明這段序列不在蛋白內(nèi)部。不連續(xù)的識(shí)別區(qū)域是代表有一定折疊的一段多肽序列，或是將兩段分離開的多肽連在一起的抗體的識(shí)別區(qū)域。在某些情況下，針對(duì)這樣不連續(xù)識(shí)別區(qū)域的抗體也能產(chǎn)生，只是用來(lái)免疫的抗原多肽必須具備與該不連續(xù)識(shí)別區(qū)域相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而序列的長(zhǎng)度需要符合相關(guān)的要求。

避免識(shí)別區(qū)域隱藏在蛋白內(nèi)部

為了避免識(shí)別區(qū)域隱藏在蛋白內(nèi)部的風(fēng)險(xiǎn)，通常選擇蛋白的N，C兩端來(lái)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。因?yàn)樵谕暾牡鞍字?，N、C兩端通常是暴露在蛋白表面的。然而，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太強(qiáng)，不適合作為抗原。

抗原設(shè)計(jì)的原則明確后，現(xiàn)在我們就來(lái)看一下設(shè)計(jì)抗原具體要怎么操作：

01

資料調(diào)研

查找蛋白質(zhì)基本信息：包括蛋白名稱、基因名稱、分子量、氨基酸數(shù)、表達(dá)部位、GeneID等，常用如下兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)：

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查找針對(duì)該蛋白質(zhì)的抗體的信息：

由于抗原設(shè)計(jì)本身具有很多的不確定性，為了降低風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省成本，所以需要參考別人做該抗體的抗原設(shè)計(jì)位點(diǎn)，盡可能多地調(diào)研相關(guān)信息，以免做無(wú)用功(例如，有些抗原只能用重組蛋白而不能用多肽，調(diào)研出這些信息就能降低很多風(fēng)險(xiǎn))。常用網(wǎng)站如下：

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02

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) (以DNAstar為例)

在)等分析圖。我們從中選擇抗原性強(qiáng)、親水性好、柔韌性好、表面可及性高、有轉(zhuǎn)角的區(qū)域，同時(shí)避免有α螺旋、β折疊的區(qū)域。

03

在線預(yù)測(cè)

設(shè)計(jì)多肽抗原時(shí)可以在 再次提交蛋白氨基酸序列，得到整個(gè)序列中每一個(gè)氨基酸的抗原性，得分高的抗原性好。

04

同源性比較(Blast)

對(duì)于多肽抗原，一般還需要比較同源性?？梢詫⑦x擇的序列在，看其同源性，同一物種中的同源性高的序列則不能選擇，不同物種之間的同源性高的則可以作為抗原。

附錄. 一些常用的數(shù)據(jù)庫(kù)和預(yù)測(cè)工具

分析氨基酸序列中是否存在信號(hào)肽：

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分析氨基酸序列中的跨膜結(jié)構(gòu)：

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基于序列的線性表位預(yù)測(cè)工具：

基于結(jié)構(gòu)的連續(xù)性和非連續(xù)性表位預(yù)測(cè)工具：

基于序列/結(jié)構(gòu)的非連續(xù)性表位預(yù)測(cè)工具：

抗原-抗體相互作用殘基數(shù)據(jù)庫(kù)：